100次浏览 发布时间：2024-09-02 08:34:43
01基础概念
质粒：质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。质粒常见于原核细菌和真菌中，绝大多数的质粒是DNA型的，少部分为RNA型。DNA载体可使目的基因在细胞内表达以达到我们的研究目的。人工改造的质粒是最常用的载体之一，通常具有以下几个特点：
1. 有一个或多个限制性内切酶的切点，便于目的基因插入；
2. 带有标记基因（抗性基因、荧光基因等），便于筛选；
3. 大小合适（一般小于10kb），便于转染。
限制性内切酶：识别DNA序列中的回文序列，并对两条链上特定碱基之间的磷酸二酯键进行切割，大多来源于细菌，根据细菌种属而命名。
选择限制性内切酶构建载体应注意：
1. 单酶切后载体容易自连必须去磷酸化，不能保证插入片段的方向；
2. 双酶切需要注意同尾酶的自连。
02构建过表达基因质粒
表达基因扩增的引物设计：
1. NCBI Gene 数据库查找基因cDNA序列；
2. 查找CDS区序列的酶切位点，对比载体上的酶切位点，避免冲突；
3. CDS区首、尾序列 + 5’端加上酶切位点和（或）保护碱基（如下图）。
表达载体构建简要流程：
1. PCR扩增出基因CDS区，1400bp左右，胶回收；
2. 双酶切胶回收产物及载体，胶回收；
3. 酶切后的产物用T4连接酶(Takara) 连接过夜，转化，鉴定。
03点突变质粒
1. 使用高保真酶进行定点突变：PrimeSTAR Max DNA polymerase
PCR合成突变质粒，DpnI消化模板质粒，转化培养，后续测序鉴定。
2. 使用无缝克隆连接进行定点突变：
PCR扩增出突变的线性化载体，无缝克隆连接成环状质粒，转化培养，后续测序鉴定。
04CRISPR/Cas9质粒的构建
原理提要
1. 切割区的选择在于PAM序列-NGG；
2. 特异性在于sgRNA的20个碱基；
3. Cas9失活：D10A、H840A突变。
sgRNA设计
1. NGG序列前面，长度20nt左右；
2. GC含量在40-60%之间；
3. 尽量以G碱基开始，最后7个碱基的靶向性要好；
4. 尽量靠近基因编码区的ATG下游，第一或第二外显子。
CRISPR/Cas9质粒的构建
1. 线性化载体；2. sgRNA双链结合；3. sgRNA与载体连接；4. 菌P鉴定。
基因敲除效果鉴定
1.Western检测蛋白表达量；
2.双sgRNA敲除，间隔200-500bp左右。鉴定引物设计在两个gRNA外侧。
